DNA超速离心

     近代质粒DNA分离纯化以从大肠杆菌中分离为代表，鉴于大局杆菌（E.coli）在分子生物学研究中的重要地位，从E.coli中分离纯化质控DNA〈Piasmid DNA〉成为近年来超离心技术中一个重要课题。而质粒DNA的快速分离纯化又对超离心设备（超速离心机、转头和附属设备）提出了更高要求。
    E.coli是典型的原核细胞生物，由于原核细胞缺乏其核细胞所具有的那种由单位膜组成的可把多种功能组分分隔为专一化的和局部独立区域的内膜系统，因而没有其核细胞所包含的细胞器（核、内质网、高尔基体、线拉体、溶酶体等等）。电镜显微照片显示E.coli有两个可以区别的内部区域一一细胞质和核质，在它们外面围着一层较薄的细胞质膜和很厚的细胞壁，在细胞壁外部附着一些一端游离的鞭毛。质粒DNA位于核区，以细丝状存在，这种细丝状物在多种情况下是极长的环状DNA的一些片断所折叠起来的聚密体。
     针对E.coli的显微结构待点，在进行超离心分离纯化质粒DNA之前的预处理顺序是：
E.coli→用溶菌酶去细胞壁→用表面活性剂如SDS、Trit X-100等EE细胞膜→用乙酸锅使DNA、RNA及蛋白质大部分沉淀(90%以上)。
     沉淀物可以在加入TE缓冲液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子筛上住去蛋白,去RNA;也可以用超速离心法去蛋白居,去RNA，去级状DNA或DNA断片。

【质粒DNA超速离心的分离方法】

     传统的分离方法：数年前，由于受设备条件限制，质粒DNA的分离一般用CsCl平衡等密度离心法，自形成梯度。以10~12ml单管容量为例，用甩平转头分离，36.000rpm×60小时，用角式转头分离45,OOOrpm×36小时，前者包括加减速在内共用去1.3亿转驱动部寿命，后者也要用去1亿转驱动部寿命，这对当时超速离心机总寿命为100~200亿转来看，无疑每次实验费用过高，加上CsCl用量多、价格贵等因素，使这类分离纯化工作成为非常昂贵的实验。

【质粒DNA超速离心分离的最新进展】

     （1）超速垂直管转头的离心分离（钦合金或碳纤维制造的）：从1975年垂直管转头向世后，近年来各主要离心机生产商开发的垂直管转头，单管容量0.2ml到4Oml，最高转速从50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可达700,OOOXg，90年代开发的新机型和转头己能够使质粒DNA垂直管离心分离实验做起来得心应手。
     （2）近垂直管转头离心分离：为了消除垂直管转头用于质粒DNA离心在壁部形成的RNA沉淀对已形成的DNA区带的污染，同时也为了改进一般斜角式转头（倾角25——35）由于沉降距离较长，因而分离时间也较长的缺点，近几年开发了多种近垂直管转头（即Near VerticalTube Rot时,简称NVT转头或Neo Angle Rotor,小假角转头,简称NT).它们的离心管纵剖面中心轴线与离心机驱动轴线之间夹角在7.5?——10?之间,转速从65,000rpm到120,OOOrpm，RCFmax可达646,000×g单管容量从2ml至13.5ml。NVT（或NT）转头的开发主要是为质粒DNA分离而设计，当然它也适用于线粒体DNA、染色体DNA、RNA及血清脂蛋白的分离?纯化。
     （3）不连续阶梯梯度分离:质校DNA分离纯化传统方法是采用金管CsCl自形成梯度平衡等密度离心法，离心开始时金管CsCl密度均一，样品均匀分布其中。